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二、常用缓冲液

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1.分子克隆常用缓冲液

2.磷酸缓冲液

(1)25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※

(2)25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※

※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml,根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值:

pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])

在此,pK’=6.86(25℃)。

3.电泳缓冲液

测序凝胶加样缓冲液

98%去离子甲酰胺

10mol/L EDTA(pH8.0)

0.025%二甲苯青FF

0.025%溴酚蓝

甲酰胺:许多批号的试剂级甲酰胺,其纯度符合使用要求,无须再进行处理。不过,一旦略呈黄色,则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理,并用Whatman 1号滤纸过滤2次,去离子甲酰胺分装成小份,充氮存于-70℃。

常用的电泳缓冲液

说明:

①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液,出现沉淀后则予以废弃。

以片都以1×TBE作为使用液(即1:5稀释浓贮液)进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1:10稀释的贮存液作为使用液。

进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小, 故通过缓冲液的电流量通常较大,需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

②碱性电泳缓冲液应现用现配。

③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2×SDS凝胶加样缓冲液:

100mmol/L Tris·HCl(6.8)

200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)

4%SDS(电泳级)

0.2%溴酚蓝

20%甘油

不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

4.凝胶加样缓冲液

使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品密度;以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,从而使加样操作更为便利,含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%~1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是,对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

5.各种pH值的Tris缓冲液的配制

某一特定pH值的0.05mol/LTris缓冲液的配制:将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积(单位:ml)的0.1ml/L HCl混合,加水将体积调至100ml

(2)温度对50mmol/LTris·HCl液pH值的影响

(6)常用缓冲液的pKa值

a:三羟甲基氨基甲烷;b:N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸;c:3-(N-吗啉代)丙磺酸;d:N,N’-双(2-乙磺酸)哌嗪;e:2-(N-吗啉代)乙磺酸。

7.温度对常用缓冲液pH的影响

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