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五、M13噬菌体重组DNA分子导入大肠杆菌

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1.感受态细胞的制备

(1)将1ml过夜培养的细菌(如DH52、TG1、TM101)接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡,通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2~0.5(5×107cells/ml),需2~4h。

(2)将培养物放于冰上致冷10min,于4℃离心细菌培养物,10000rpm离心10min。

(3)弃除上清,将细菌悬浮于原始培养体积的一半(约50ml)的50mMCaCl2和10mmTris·HCl(pH8.0)无菌冷冻液体中。

(4)将细菌悬浮放在冰上约5min,然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。

(5)弃上清,悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl(pH8.0)无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞,即可用于转化。200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中,贮存于-80℃冰箱中。

2.转化程序

(1)取出200μl感受态细胞慢慢使其溶化,并立即放于冰上,加入DNA或连接反应混合物,DNA量通常≤50mg。用手指弹打试管10次,使之混匀,然后放在冰上40~45min。

(2)将管放于42℃水浴中2min。

(3)然后每管直接加入1.0ml2×YT培养基,倒置混匀,并于37℃培养8~12h,干浴或水浴,不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。

(4)每200μl转化混合物分别于6个2×YT琼脂培养板上补充相应抗生素,并含有X-gal(20mg/ml)、IPTG(200mg/ml)。

(5)铺板使细菌混合物干后,倒转平板放于30~37℃培养箱中18~22h。克隆在此期间应该出现,否则转化不成功。

 

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