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第一节 血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价

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一、载脂蛋白测定方法

1.单向免疫扩散法(radialimmunodiffusion,RID)

该法较简单,一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清,扩散过程至少24h,最多需72h,测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单,应严格控制有关条件如:含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀;加入小孔的稀释抗原(血清)量要准确;含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一,如琼脂糖凝胶浓度在1.5%~2.0%,可能仅测出LDL的ApoB,大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出,因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外,扩散过程中,凝胶板一定要水平,否则易使扩散环呈椭圆形,难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5~10.0mm为宜,应在两个方向测量直径,其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值,测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。

2.电免疫测定法(electroimmunoassay,EIA)

该法灵敏,抗血清用量少,如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸,其电泳时间可缩短一倍,火箭峰高以1~4cm为宜,火箭峰的测量可以计算面积或峰高,峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml,又称为火箭电泳法。

3.免疫比浊法(immunoturbidimetryassay,ITA)

简便快速,在自动分析仪进行操作并能批量检测,是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种:一是测定光散射的,又名免疫散射比浊法(INA);需用特殊的激光浊度仪;另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度,称为透射免疫比浊法(ITA),其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定,速率法是根据散射光强度与时间的关系,以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度,后者与溶液中抗原量成正比,常可在1min内完成测定过程,可自动扣除空白;终点法比速率法稳定,一般多用终点法。

4.酶联免疫法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)

该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定,可测出ng级水平的抗原或抗体含量,该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。

5.放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)

该法灵敏,抗血清用量少,所需设备较多,一般用125I标记抗原作为示踪物,除ApoC-Ⅰ(不含酪氨酸)以外,都可以作碘标记(氯胺T法),以双抗体法测定RIA法可检测最低至3~5ng。临床检验中不常用此法,主要用于动物实验的科学研究工作。

还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。

血清载脂蛋白测定的方法,从测定原理、方法学评价及参考值,刘秉文和李健斋等人作了大量的工作,为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB100血清,其后,国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清,并广泛应用于临床的疾病诊断,在部分大医院已成为常规检查项目。

刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值,本节将引用如下比较表:

表18-1 ApoAⅠ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID INA ITA 抗体 P,M P,M P P,M P P 灵敏度(n) 0.3~10 0.1~0.5 100 100 150 100 测定范围(ng) 1~200 0.5~15 100~500 200~800 200~500 200~600 批内CV(%) 3~9 4~8 3~5 6 3~7 1 批间CV(%) 5~10 8~10 3~9 10 6~7 6 正常值(g/L) 1.0±0.2 1.5±0.2 1.2±0.2 1.2±0.1 1.2±0.2 1.7±0.2

P:多克隆抗体;M:单克隆抗体;RIA:放射免疫法;ELISA;酶联免疫法;RID:单向免疫扩散法;INA:免疫散射比浊法;ITA:免疫透射比浊法。

(源自:刘秉文,1995.)

表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID INA ITA 抗体 P P,M P P P P 灵敏度(g) 0.5   20 5 30 20 测定范围(ng) 1~20 5~50 30~60 50~400 50~900 40~150 批内CV(%) 7 8 5 5 5 5 批间CV(%) 9 7 8 - 7 6 正常值(g/L) 0.25±0.4 0.35±0.05 0.76±0.2 0.29±0.02 0.37±0.09 0.36±0.03

(源自:刘秉文,1995.)

表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA 抗体 P P P 灵敏度(g) 5 0.2 20 测定范围(ng) 5~50 0.5~8 50~200 批内CV(%) 5 3.60 5 批间CV(%) 7 8 9 正常值(g/L) 0.17±0.03 0.14±0.05 0.14±0.04

(源自:刘秉文,1995.)

表18-4 ApoB100免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID INA ITA 抗体 P,M P,M P P,M P P 灵敏度(n) 5~10 2~20 50~300 300 300 300 测定范围(ng) 0~100 2~10 20~500 50~600 300~500 100~500 批内CV(%) 4~8 4~7 1~7 3~7 4~7 2 批间CV(%) 7~11 10 3~10 6~7 7~8 2 正常值(g/L) 0.9±0.2 0.85±0.1 0.6±0.3 0.8±0.2 0.8±0.2 0.8±0.3

(源自:刘秉文,1995.)

表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较

  RIA ELISA INA 抗体 P P P 灵敏度(n) 1 5 50 测定范围(ng) 5~30 15~100 - 批内CV(%) 7 3 5 批间CV(%) 9 5 8 正常值(g/L) 0.05±0.03 0.06±0.002 0.06±0.01

(源自:刘秉文,1995.)

表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID ITA 抗体 P P P P P 灵敏度(g) 10 0.3 45 40 10 测定范围(ng) 10~80 0.5~5 70~600 40~600 12~50 批内CV(%) 6 3 6.5 2.1 3.3 批间CV(%) 10 8 8.2 3.9 6.2 正常值(g/L) 0.04±0.01 0.033±0.008 0.04±0.002 0.039±0.017 0.04±0.01

(源自:刘秉文,1995.)

表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID INA ITA 抗体 P P P P P P 灵敏度(g) 1 0.3 10 76 20 15 测定范围(ng) 2~20 1~6 20~80 76~600 50~400 30~120 批内CV(%) 13 4.3 8 2.5 6.3 5.2 批间CV(%) 13 4.3 8 3.5 6.3 5.2 正常值(g/L) 0.15±0.06 0.16±0.03 0.12±0.04 0.127±0.037 0.12±0.03 0.11±0.03

(源自:刘秉文,1995.)

 

二、人血浆(清)载脂蛋白参考值比较

刘秉文于1995年对国人血浆(清)各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较,其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。

表18-8 ApoE免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID ITA 抗体 P P,M P P P 灵敏度(n) 0.2~8 0.5 20 35 5 测定范围(ng) 0.8~100 0.5~6 20~200 50~300 20~400 批内CV(%) 6 4 8 5.9 2 批间CV(%) 9 8 5 7.2 5 正常值(g/L) 0.05±0.02 0.04±0.01 0.10±0.04 0.035±0.01 0.04±0.01

(源自:刘秉文,1995.)

表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较

作者 发表时间 方法 例数 性别 年龄 均值±s(mg/dl) 张祖辉 1998 RID 307 男 20-77 122.1±13.7 刘秉文     318 女 20-77 125.5±15.9 李键斋等 1986 EIA 291 男+女 19-50 119±17 周新等* 1990 EIA 692 男 13-85 129.1±16.1   477 女 18-80 130.5±14.2 Albers等 1976 RID 20 男+女 11.5±7.3 115.7±7.3 Cheung等 1977 RID 172 男 20-65 120±20 188 女 20-65 135±25 Reman等 1978 RID 95 男 40-49 137±23 104 女 40-49 137±23   Schonfelcl等 1974 RIA 41 男 13-58 100±35 34 女 16-58 104±34   Karlin等 1976 23 男 20-39 130±3 19 女 20-39 154±6   Avogaro等 1978 EIA 60 男 20-60 128±22 60 女 20-60 134±20   Mordasini等 1980 EIA 50 男 20-60 113±9 50 女 20-60 125±17   Miller等 1980 EIA 8 男 34-70 122±27 8 女 52-68 149±20   Rosseneu等 1981 IAN 12 男 29 139±15 14 女 30 147±24   Assmann等 1982 INA 3032 男 20-65 136±23 1367 女 20-60 146±25  

(源自:刘秉文,1995)

*:作者补充。

表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较

作者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl) 罗静聪 1988 RID 76 男+女 26.7±4.6 刘秉文 1988 ELISA 41 男+女 24.2±5.9 胡维诚 1987 RID 160 男+女 27.0±4.4 Curry等 1976 RID 19 男 78.0±1.7       19 女 83.0±25 Cheung等 1977 RID 172 男 33.0±5       188 女 36.0±6 Assmann等 1977 EIA 15 男 34.1±5       15 女 38.3±5.5 Schonfeld等 1977 RLA 29 男+女 40.5±8.9 Maupovic等 1981 ELA 50 男+女 68.0±18 Goldberg等 1980 RIA 50 男 25.0±1       50 女 26.0±1 De Backnev等 1982 INA 70 男+女 43.0±6.9 Zech等 1983 RID 27 男+女 24.0±0.6 Noma等 1983 RLA 27 男+女 32.0±8.3 Nukita等 1984 EIA 156 男+女 40.0±9

(源自:刘秉文,1995)

表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较

作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl) 周新等 1986 EIA 608 男 83.2±13.9       511 女 80.4±13.4 李健斋等 1986 EIA 727 男+女 76±19 吴兆丰、刘秉文 1987 RID 304 男 87.9±14.4       320 女 86.7±14.4 Albers等 1975 RIA 349 男+女 81.0±20 Bantorich等 1975 RIA 82 男+女 90.0±24 Bedford等 1976 RIA 128 男+女 87.0±30 Schonfeld等 1974 RIA 42 男+女 83.0±16 Brussaard等 1980 EIA 60 男+女 63±16 Fruchart等 1981 EIA 144 男+女 90 Curry等 1978 EIA 38 男 90±2.0       36 女 88±11 Curry等 1978 RID 20 男+女 87±26 Lees等 1970 RID 64 男+女 83±25 Snuderman等 1975 RID 31 男 82±22 Fievet等 1979 INA 206 男 129±31       271 女 120±34 Heuck等 1979 INA 68 男+女 82.0±23 Rossenue等 1981 INA 70 男 92±13 Durrington等 1976 INA 29 男+女 85±11

(源自:刘秉文,1995)

表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较

作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl) 傅明德等 1987 ELISA 202 男 7.6±2.5       214 女 8.0±2.3 Polz等 1980 RID 10 男+女 6.9±2.0 Curry等 1981 ELA 68 男+女 6.0±1.5

(源自:刘秉文,1995)

表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较

作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl) 傅明德等 1987 ELISA 202 男 5.2±1.9       241 女 4.9±1.8 范萍等 1989 RID 67 男+女 3.9±1.7 Schonfeld等 1979 RIA 93 男+女 3.9±1.4 Curry等 1981 EIA 68 男+女 4.0±2.0 Kashyap等 1977 RIA 32 男+女 5.0±0.4

(源自:刘秉文,1995)

表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较

作者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl) 傅明德等 1988 ELISA 134 男 11.6±3.6       135 女 12.0±3.7 范萍等 1989 RID 67 男+女 12.7±3.7 刘秉文等 1987 IRA 21 男+女 9.2±2.1 Schonfeld等 1979 RID 93 男+女 15.4±6.2 Curry等 1980 ELA 54 男+女 10.9±3.0 Kashyap等 1981 RIA 29 男+女 11.1±0.9

(源自:刘秉文,1995)

表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较

作者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl) 刘铭锋、刘秉文等 1987 ELISA 42 男+女 3.57±1.24 刘铭锋、刘秉文等 1987 ELA 50 男+女 4.70±1.18 刘铭锋、刘秉文等 1992 RID 116 男 3.95±0.98       122 女 4.00±1.32 张东升、夏辉明 1991 ELISA 25 男+女 3.45±1.24 Blum等 1980 RIA 26 男+女 3.6±1.3 Gregg等 1984 RIA 12 男+女 4.8±1.2 Wesgraber等 1984 RIA   男+女 5(3.5-7.0)

(源自:刘秉文,1995)

王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数,如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外,并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录,供参考。

表18-16 血脂与脂蛋白水平(mmol/L)

项目 男(225例) 女(58例) P值 TC 4.87±0.73 5.16±0.84 <0.05 TG 1.27±0.66 1.25±0.71 >0.05 HDL-C 1.41±0.35 1.54±0.36 <0.02 HDL2-C 0.56±0.17 0.63±0.19 <0.02 HDL3-C 0.86±0.23 0.91±0.19 >0.05 LDL-C 2.95±0.68 3.13±0.12 >0.05

(源自:王抒,1996)

表18-17 几项常用比值*

项 目 男 女 LDL-C/HDL-C 2.21±0.72 2.16±0.80 HDL2-C/HDL3-C 0.66±0.12 0.69±0.15 ApoB/ApoAⅠ 0.72±0.16 0.74±0.17 ApoAⅠ/ApoAⅡ 4.10±0.65 4.10±0.68 ApocⅡ/ ApoCⅢ 0.39±0.12 0.41±0.16

男女组间无显著意义

(源自:王抒,1996)

表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数

项目 X±S p5 p25 p50 p75 p95 男(225例)             ApoAⅠ(g/L) 1.42±0.17 1.17 1.30 1.43 1.51 1.72 ApoAⅡ(g/L) 0.36±0.66 0.28 0.32 0.35 0.40 0.46 ApoB(g/L) 1.01±0.21 0.72 0.86 1.00 1.14 1.38 ApoCⅠ(mg/L) 53±17 31 43 50 60 83 ApoCⅡ(mg/L) 34±16 13 24 31 42 69 ApoCⅢ(mg/L) 44±17 26 34 41 51 74 ApoE(mg/L) 44±17 26 34 41 51 74 Lp(α)(mg/L) 144125 26 53 107 185 382 女(58例)             ApoAⅠ(g/L) 1.45±0.14 1.21 1.34 1.44 1.55 1.74 ApoAⅡ(g/L) 0.36±0.06 0.26 0.33 0.36 0.39 0.44 ApoB(g/L) 1.07±0.23 0.71 0.90 1.08 1.20 1.49 ApoC(mg/L) 53±18 30 39 51 61 92 ApoCⅡ(mg/L) 41±18 20 28 38 49 77 ApoCⅢ(mg/L) 104±40 52 72 100 129 184 ApoE(mg/L) 51±18 33 37 48 58 89 Lp(α)(mg/L) 154±116 35 66 117 207 464

国内的已有报道表明,人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起这种差异的原因是多方面的,目前认为主要原因有:①检测方法与仪器不同;②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一;③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清;④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立,尚需付出艰辛的劳动。

 

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