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二、血清脂蛋白琼脂糖电泳法

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(一)原理

以琼脂糖凝胶为支持介质,先用脂类染料将血清进行预染,使血清脂蛋白着色,然后电泳。切下各脂蛋白区带,加热溶解,冷却后比色。或者用光密度计直接扫描仪定各区带。计算出α、β-和前β-脂蛋白的相对百分比。

(二)试剂

1.巴比妥HCl缓冲液(pH8.6,离子强度0.075):称取巴比妥钠15.5g,加入1mol/LHCl12ml,混匀溶解,加蒸馏水至1000ml,此为电极缓冲液。

2.巴比妥-HCl缓冲液(pH8.6,离子强度0.05):称取巴比妥钠10.3g,加入1mol/LHCI8ml,混匀溶解,加蒸馏水至1000ml,用于配琼脂糖凝胶用。

3.0.8%琼脂糖凝胶:取琼脂糖0.8g,溶于配琼脂糖凝胶的缓冲液100ml,置沸水煮溶或置于微波炉中热溶解。

4.1%苏丹黑B的石油醚-乙醇(1:4,V/V)溶液。

(三)操作

1.预染血清:吸血清0.2ml于一小试管中,再加苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml。混匀后置于37℃水溶预染20min。取出各管,2000r/min离心5min,以除去多余的染料。

2.琼脂糖凝胶板制备:将0.8%琼脂糖凝胶溶解后,吸2.5ml到载玻片上,趁热将刻点样槽用有机玻璃盖放在距载玻片一侧近1cm处。一块载玻片前后可打两个槽点两份样品。

3.点样与电泳:取下凝胶上有机玻璃盖并显出一加样小槽。取预染血清40μl,注入此小槽中。在电泳槽内加入巴比妥电极缓冲液,样品端为负极。以四层滤纸或沙布搭桥按10V/cm电泳,待预染血清电泳至最高或40min,切断电源。

4.定量:

(1)切割比色法:将凝胶板上各脂蛋色带分别切开置于装入有3ml蒸馏水的试管内。切相应大小的空白琼脂糖放入3ml蒸馏水试管内,为空白管,各管放入沸水煮3min,琼脂糖溶解,待冷,以空白管调零点,于660nm处比色,记录吸光度,以α-、前β-和β-脂蛋白三条区带吸光度总和,比各自区带的吸光度,求其百分比。这种半定量方法不够准确,误差很大。

(2)扫描定量:预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕,其琼脂糖凝胶板上有色带,可直接置于光密度扫描仪扫描,并得出各区带的百分比,如果输入该病人的血脂总量,即可算出α-、前β-和β-脂蛋白的各自含量,如图16-2所示。

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