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六、杂交前处理

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1.蛋白酶(Proteinawe K, Pro.K) 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理,其作用是使组织达到一定消化,利于检测分子的穿透,从而提高检测方法的敏感性,但各种组织在不同条件下消化程度不一,因此,具体应用时,应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏,核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液(1mg/ml),临用前,再配成工作液(约0.025mg/ml)。配制方法:

精心称药,将二者充分混合后,分装成小份,-20℃存放,用时再取出冻融,余者弃去。

(2)工作液(临用前配):

取储备液(1mg/ml)按1:40稀释,充分混合,即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。

(3)关于P-K缓冲液的配制:

称取上述试剂,充分混合即可。

②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0):

先将Tris于800ml ddH2O中溶解,用HCl将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml,高压灭菌,室温备用即可。

③0.5mol/L的EDTA:

称取EDTA溶于约600ml ddH2O中,常需60℃持续搅拌以助溶,滴加NaOH至pH接近8.0时,EDTA才开始溶解。待完全溶解后,冷却至室温,NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml,高压灭菌,室温备用。

2.甘氨酸

(1)1mol/L甘氨酸:

称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中,最后补足ddH2O定容至1000ml,高压灭菌备用。该液为储备液,-20℃储存。

(2)甘氨酸工作液(0.1mol/L):

将二者按1:10比例稀释,即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。

甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用,以防过度消化。

3.0.25%醋酸-0.25%醋酸酐

配制:按上述配方,先以少许DEPC水溶解NaCl,然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml),临用前,一边摇动溶液一边加入醋酸酐,充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出,最好在通风条件下进行。

生物体内有些组织,如神经组织中的蛋白质,对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后,可使切片标本表现带上负电荷,有排斥带负电的核酸探针,减少非特异吸附,降低反应背景的作用。

4.RNA酶溶液

取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中,分装成小份(1ml,10mg/ml),-20℃储存。

临用前,取RNA酶A储备液,用2×SSC溶解配成工作液(0.01mg/ml).

5.0.2%

取2ml Triton X-100加入998ml PBS中,充分振荡使其充分混合。

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