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三、显色液

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免疫细胞化学中,由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色,无法直接观察,因而需借助于某些化学基团的呈色作用,使其得以显示,以利于在显微镜下观察。常用的显色液有:

1.DAB(Diaminobenzidine)显色液

DAB即3,3-二氨基苯联胺

试剂:DAB(常用四盐酸盐) 50mg

0.05mol/L TB  100ml

30% H2O2 30~40μl

配制方法:先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB,然后加入余量TB,充分摇匀,使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230~40μl,使其终浓度为0.01%。

DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法(如酶标法、PAP法等),其终产物可直接在光镜下观察,也可经OsO4处理后,增加反应产物的电子密度,用于电镜观察。但有几点需注意:DAB溶解要完全,否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察;DAB浓度不易过高,否则显色液呈棕色,增加背景染色,另外DAB有致癌作用,故操作时应戴手套,尽量避免与皮肤接触,用后及时彻底冲洗,接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。

2.4-氯-1-萘酚(4-Cl-1-Naphthol)显色液

配方1:4-Cl-1-萘酚100mg

纯乙醇 10ml

0.05mol/L TB(pH7.6)190ml

30% H2O2 10μl(0.003%)

配制方法:先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中,然后加入Tb 19ml,用前加入30% H2O2使其终浓度为0.005%,切片显色时间通常为5~20min。

配方2:4-Cl-1-萘酚

N-二甲基甲酰胺(DMF)

0.05mol/L TB(pH7.6)

30% H2O2

配制方法:先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中,加热溶解使呈乳白色,再加入TB,乳白色变为絮状,在7.5℃加热5min后加入H2O2,搅动使絮状消失,趁热过滤,当降至略低于50℃时才放入组织标本(注意:温度过高易损伤标本,过低则易重新出现沉淀)。显色时间通常为5min左右。

4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。

多数认为最好去除白色沉淀(如上述),但Larsson等认为,白色沉淀可作为背景,使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本,勿用酒精脱水。

3.3-氨基-9-乙基卡唑(3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)显色液

试剂:AEC 20mg

二甲基甲酰胺(DMF)2.5ml

0.05mol/L醋酸缓冲液(pH5.5)50ml

30%H2O225ml

配制方法:先将AEC溶于DMF中,再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前,加入30%H2O2。切片显色时间为5~20min。

该显色液作用后,阳性部分呈深红色,加以苏木精或亮绿等作为背景染色,则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水,故需用甘油封固。

4.TMB显色液

试剂:TMB

HCl

亚硝基铁氰化钾

无水酒精

配制方法:

(1)醋酸盐缓冲液:取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合,再加蒸馏水稀释至1000ml,用醋酸或NaOH将pH调至3.3。

(2)A液:取上述缓冲液5ml,溶解100mg亚硝基铁氰化钾,加蒸馏水92.5ml混合。

(3)B液:称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中,可加热至37℃~40℃直到TMB完全溶解。

(4)孵育液:放入标本前数秒,取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充分混合。(液体在20min内应保持清亮的黄绿色,否则可能已有污染)。酶反应时,加入终浓度为0.005%的H2O2。

(5)主要显色步骤:组织标本在蒸馏水(或PBS)中漂洗数次(每次约10~15min)后放入未加H2O2的孵育液中作用20min(19℃~30℃),然后向孵育液中放入H2O2(每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0~5.0ml)继续孵育液20min左右(19℃~23℃),捞出标本漂洗数次(共30min左右)。在0~4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴片、脱水,封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2~3min,也可在1%派诺宁(pH3.3~3.5)中负染5min后贴片、脱水、封片。

TMB即四甲基联苯胺(Tetrabenzidine)是一种脂溶性较强的基团,因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应,且由于这种高度的脂溶性,使其易形成多聚体,在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物,这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀,使得HRP的活性部位更加暴露,利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色,利于光镜观察,且反应产物越聚越大,常超出单个细胞器的范围(而DAB则被限制在其内),故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点,目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是:TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外,TMB是一种较强的皮肤刺激剂,并有致癌的潜在可能,故使用时应带手套及在通风条件下操作。

5.NBT显色液

试剂A液:5%NBT:称取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF(二甲基甲胺)内,充分混合,常存于4℃,也可装成小份,-20℃保存,用前复温。

B液:5% BCIP:称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内,混匀。4℃或分装存于-20℃,用前恢复至室温。

C.显色液:取A液40μl,加入到盛有10ml的0.1mol/lTris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、5mmol/LMgCl2)管内,充分混匀;再加入B液40μl,轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。

NBT即四唑氮蓝(Nitro-Blue-Tetrazolium),MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)。当二者存在时,在碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)作用下,NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。

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