中医书籍-->西医备考-->实用免疫细胞与核酸-->第二十三章 DNA重组技术及其在基因诊断中的应用-->第二节 分子克隆载体-->四、其他载体-->(二)人工微小染色体

(二)人工微小染色体

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应用的最广泛的质粒载体是pBR322,它属松弛型质粒,有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因,有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352个核苷酸,排列顺序已全部测定,基本结构如图23-3。

当需要用pBR322来克隆BamHI酶切的一个DNA片段时,一般的做法是如图23-4所示。

图23-4 pBR322克隆DNA片段的程序

从图23-4可见,外源DNA片段同pBR322都经Bam HⅠ酶切,所以有相同的单链“粘性末端”,通过DNA连接酶可以构成重组DNA分子。由于pBR322的BamHⅠ酶切点在四环素的抗性基因中,所以Bam HⅠ酶切后使这个抗性基因失活。如果酶切后的质粒pBR322自身又重新连接,则恢复对四环素的抗性,转化子就仍然具有对二种抗生素的抗性。如果pBR322中插入外源DNA,则转化子失去了四环素抗性表型,而只有对氨苄青霉素的抗性,这样就可根据转化子的抗性而把重组质粒转化的细菌选出,然后扩增细菌,大量回收质粒DNA,从而达到大量扩增外源DNA的目的。

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