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四、反向PCR(Inverse PCR或Reverse PCR)

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反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA(见图22-2)。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列,因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补,但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子,通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶,或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列,而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列,这样,通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知DNA片段的序列,并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆,建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

图22-2 反向PCR原理示意图

波浪线代表靶DNA,方块代表测翼序列,▲和△代表限制酶切位

点,寡核苷酸引物与模板互补处标有平箭头

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