中医书籍-->西医备考-->实用免疫细胞与核酸-->第二十二章 聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用-->第三节 PCR操作范例及反应体系的组成-->三、DNA聚合酶

三、DNA聚合酶

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早在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶,并且得到了DNA聚合酶Ⅰ纯品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量为109000的一条多肽链构成,此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段,一个片段分子量为76000,有聚合酶活性,并有3’→5外切酶活力,即Klenow片段(Klenow fragment)。另一个片段分子量为34000,具有5’→’3’外切酶活力。因此,DNA聚合酶具有几种功能:一是聚合作用,以DNA为模板,将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。二是有’3’→5’外切酶活力,能识别和消除错配的引物末端,与复制过程中校正功能有关。三是5’→3’外切酶活力,它能从5’端水解核苷酸,还能经过几个核苷酸起作用,切除错配的核苷酸。1985年Mullis 等发明了PCR方法,以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR后,世界上许多实验室就考虑用耐热DNA聚合酶代替Klenow片段进行PCR,使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生活于60℃(B.Stearothermophilus)到87℃(S.Solfatavicus)的许多菌中分离纯化出耐热DNA聚合酶,但有些酶不能耐受DNA变性所需温度,所以无法应用于PCR。现就PCR反应中常用的DNA聚合酶等作一详细介绍。

1.Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及应用的关键。Klenow片段不能耐受95℃的双链DNA变性温度,所以每次循环都要加入新酶;而Taq DNA聚合酶可以耐受93~95℃的高温,避免了不断补加多聚酶的繁琐操作,同时使退火和延伸温度得以提高,减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰,增进了PCR特异性、产量和敏感度,二者相比,其主要区别在于:①Klenow酶的最适温度为37℃,扩增的产物并非全是目的序列,需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为74~75℃。因而使退火温度可以提高,使退火严格性提高,减少错配引物的延伸。②循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数,Klenow酶为20个(均用1μg基因组DNA开始)而Taq酶为30个。③延伸片段长度Taq酶为10kb以内,而Klenow酶为400bp以内。

Taq酶由水栖高温菌(Thermusaquatics)YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉,作为栖热杆菌的标准菌株,其生长温度为70~75℃。最初从中分离到分子量60~68KDa,比活性为2000~8000U/mg的DNA聚合酶。后来Cetus公司的Kary Mullis等又分离到比活为20万U/mg的纯酶,分子量为93910。此种9.4KDa酶的最适温度为75~80℃,与单纯核苷酸的结合率(Kcat)可达150核苷酸(nt)/s酶分子。以M13模板,用富含G+C的30bp引物延伸,70℃时Kact>60nt/s;55℃可达24nt/s;37℃时为1.5nt/s,而22℃时低至0.25nt/s。高于90℃时DNA合成活性甚差,这种高温条件下,引物与模板已不能牢固结合。

在PCR反应混合液中,Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的时间分别为130、40及5~6min,在50次循环的PCR中当管内最高温度为95℃。每循环为20s时尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半寿期为40min,故在PCR循环中选用的变性温度,不宜高于95℃。

Taq酶现已可用基因重组的方法生产,商品名为Ampli Taq(Cetus公司)。Taq酶的完整基因长2499bp,在大肠杆菌中表达生产,含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的,包括对dNTP结合,引物与模板作用区均存在于Taq酶中。

Taq酶具有依赖DNA合成的5’→’3’外切酶活性,因此,模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻断物”,会被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸,而对于5’-32P标记的合成寡核苷酸引物,则无论是单链或是与模板复性,都未发现降解,所以该种活性不会影响PCR结果。Taq酶没有3’→’5’外切酶活性,如果发生dNTP错误掺入,这种酶没有校正能力,因此运用Taq酶进行PCR,产物中点突变较多,对克隆等不太有利。一般错掺率为1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs浓度分别为200μmol/L,Mg2+为1.5mmol/L,在55℃退火)。但不含3’→5’外切酶活性对测序有利。

2.影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2+离子的影响。用鲱精DNA为模板,总dNTP浓度0.7~0.8mmol/L,Mg2+为2.0mmol/L时激活能力最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力达40%~50%。dNTP能与Mg2+结合,故游离Mg2+只是结合后剩余的量。若总dNTP浓度高至4~6mmol/L时,Taq酶活力要降低20~30%,即底物抑制。

dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高,适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA(dNTP消耗一半)。

表22-3 有机溶剂对Taq聚合酶活力的影响

用鲱精DNA,70℃,10min内dNTP的掺入量计算,标准条件为100%。

纯9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力。误掺入率取决于dNTP浓度。但Taq酶具有DNA依赖的链移位5’→3’核酸外切酶活力。对5’→3’32P标记寡核苷酸单链,或与MB模板杂交时均只有极少的降解力。

中等浓度KCl能刺激Taq酶合成活力达50%~60%,最佳KCl浓度为50mmol/L,浓度更高有抑制作用,>200mmol/L的KCl可使酶失活。

加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可产生中度抑制或无作用。

低浓度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影响不大,吐温20/NP40可消除SDS(0.01%及0.1%)的抑制作用。

3.第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段:Cetus公司的Stoffel将TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段(N端289个氨基酸)去除,称为stoffel片段。其97.5℃的半衰期从Taq DNA聚合酶的5~6min提高到20min,同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合PCR(Multiplex PCR)更为有利。

VentTMDNA多聚酶:是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔(Vent)中分离的超级嗜热菌-能生长于98℃中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的,故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq DNA聚合酶更为优越,它能耐100℃高温且2h以上仍有活力,并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力,错误扩增的机率比Taq酶降低一倍。后来该公司又从深水潜艇(2010m)排气孔分离的能在104℃生长的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表达的Deep Vent DNA聚合酶,在95℃的半寿期达23h(Vent酶为6.7h,Taq酶为1h)。

4.RTth逆转录酶(rTth Reverse Transcriptase)目前逆转录-PCR(RT-PCR)的发展很快,所以对耐热的依赖于RNA的DNA多聚酶的研究也有进展。有实验表明Taq DNA多聚酶有依赖于RNA的DNA聚合酶活性,但活性较弱。Cetus公司于1991年推出一种rTth Reverse Tran-scriptase,有很好的依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性,二种活性分别依赖于Mn2+Mg2+,这样就可分别控制酶活性。利用该酶只需250ng的总RNA即可有效地进行RT-PCR,得到特异的DNA片段,从而非常有利于逆转录PCR的发展。

耐热DNA聚合酶的研究近几年来得到长足的发展,这在PCR发展中起到了重要的作用。我们相信随着进一步的研究,将使人们对耐热DNA聚合酶的认识和应用更进一步地发展。

我国的PCR研究发展很快,其关键试剂-耐热DNA聚合酶-也已有几个实验室能够分离纯化,如复旦大学遗传学研究所、华美公司、中国医学科学院基础医学研究所。后二者的菌株为Thermus aquaticus YT-1。前者则是从自己筛选的嗜热菌中分离纯化,复旦大学遗传所亦已成功地克隆了该聚合酶的基因并获得了耐热F4DNA聚合酶,其酶学性质非常接近于Taq DNA聚合酶,为我国PCR的开展提供了保证。

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