中医书籍-->西医备考-->实用免疫细胞与核酸-->第二十一章 原位杂交技术在染色体和电镜水平的应用-->第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用-->一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片(Hutchison et al,1982)

一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片(Hutchison et al,1982)

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(1)将整封染色体铺片放置于金网上,在70%的酒精蒸汽固定4~15h,空气干燥。

(2)以强碱使DNA变性,将金网置于2×SSC内(应用0.1n NaOH调整至pH12),室温,2min。

(3)脱水,以70%和95%酒精各冲洗3次,空气干燥。

(4)杂交,金网覆于平面玻璃皿( Petri dish)内的杂交液滴上,每滴约10~15μl,将此小碟置于盛于杂交缓冲的大塑料盒内,保持湿润,在60~65℃孵育4~24h。

杂交液的配制:6×SSC或6×TNS(1×TNs =0.1mol/L NaCl,0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000~50000cpm/10μl3h cRNA)。

(5)杂交后冲洗,金网自杂交液中取出后立即用大量的2×SSC冲洗多次。RNA酶溶液(20μg/ml)室温冲洗,然后再用2×SSC室温冲洗,冲洗后梯度酒精脱水(70%,95%)空气干燥。

(6)浸入乳胶膜,应用L-4核乳胶液,水稀释4倍。浸膜后的金网,用胶带固定在载玻片上放在密封的黑色塑料盒内,4℃,时间根据同位素种类和靶mRNA含量而定,也可选择不同时间曝光,根据显影强弱确定最终显影的时间。

(7)显影。暗盒自冷房或冰箱中取出后,在室渐中回暖至少30min,以防核乳胶膜皱缩。然后在显影液(Kodax Microdol X)显影3~5min,温度18~24℃。水冲,在15% Kodax快速定影液定影5min,然后在空气中干燥。

所有溶液应尽可能新鲜配制。

(8)电镜观察。

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