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一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序

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(1)切片入PBS冲洗5min,最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。

(2)0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。

(3)0.4%Triton X-100 PBS 15min。

(4)1μg/ml蛋白酶K,37℃保温30min。

(5)4%多聚甲醛PBS固定5min 。

(6)PBS冲洗2×3min。

(7)0.25%乙酸酐(0.1mol/L 三乙醇胺配)10min。

(8)2×SSC冲洗10min。

(9)杂交:如是cDNA探针用前需进行变性处理,载片法时将切片在空气中晾干,加含探针的杂交液10μl于切片上,盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜,3H标记探针每10μl杂交液含1×105cpm探针,32P或35S标记探针每10μl杂交液含5×105cpm探针;如是漂浮切片,则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干,然后入杂交液,探针浓度和载片法一样。入杂交液后43℃保温12~16h。

(10)4×SSc 37℃冲洗10~30min。

(11)2×SSC(如为RNA探针则含20μg/ml RNase)37℃冲洗30min。

(12)1×SSC和0.1×SSc 37℃分别冲洗30min。

(13)PBS冲洗2×5min。(转录ISHH)

(14)0.5%H2O2PBS室温30min。

(15)1%BSA 37℃,30min 。

(16)第一抗体,4℃孵育16~24h。

(17)PBS冲洗4×5min。

(18)第二抗体37℃,1h。

(19)PBS冲洗3×5min。

(20)兔PAp 37℃,1h 。

(21)PBS冲洗3×5min。

(22)DAB显色液5~10min(DAB显色液:0.05%DAB + 0.03% H2O2PBS液配)。

(23)PBS冲洗3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上,晾干。

(24)切片入70%,85%,95%和2个100%酒精脱水,空气干燥。

(25)在暗室涂布乳胶(乳胶配制:乳胶原液:0.6mol/L醋酸胺=1:1),晾干,装入自显影暗盒。

(26)4℃曝光:3H标记探针4~8周,35S标记探针1~4周,32P标记探针7~10天。

(27)D196显影液,20℃显影5~10min。

(28)自来水冲洗数秒。

(29)F5坚膜定影液10min。

(30)自来水冲洗15min。

(31)切片温箱烤干,脱水,透明,封片。

结果:蛋白或多肽免疫反应阳性细胞为棕色胞质,而其相应mRNA为黑色银颗粒聚集。

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