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二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用

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(一)光敏生物素标记cRNA探针的应用

以线性质粒DNA为模板合成未加标记物的cRNA探针,使其最终浓度为0.5~1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再与等体积的光敏生物素(1μg/μl)混合。在150瓦卤素灯下,距离光源20cm处照射30min。用仲丁醇抽提游离生物素,再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探针,将其溶于适量的灭菌双蒸水,用紫外分光亮度计测探针的光密度(详第十九章 ),其最佳工作浓度为2μg/ml。

切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节 。

光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序:

(1)石蜡切片脱蜡入水后,置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min;冰冻切片直接入PBS冲洗5min。

(2)0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。

(3)0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。

(4)蛋白酶K1μg/ml(0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保温30min。

(5)4%多聚甲醛PBS固定5min。

(6)0.1mol/l PBS冲洗2×3min。

(7)0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。

(8)2×SSC冲洗10min(1×SSC:0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠)。

(9)取10μl含相应探针的杂交液滴于标本上,如果是cDNA探针则用前将探针于95℃水浴中保温10min,马上放入冰浴中冷却,然后再用。

(10)盖上22×22mm的硅化盖片或合适大小的蜡膜,入温盒43℃保温12~16h。

(11)4×SSC洗脱盖片,并在同一液中37℃漂洗10~30min。

(12)2×SSC(含20μg/mlRNaseA, 适于RNA探针)冲洗30min,37℃。

(13)1×SSC,0.1×SSC,37℃各漂洗10~30min。

(14)0.05mol/l PBS 冲洗4×5min。

(15)3%BSA(0.4%Triton X-100 PBS配)37℃保温30min。

(16)Avidin –AKP(碱性磷酸酶)(1:500~1:100,0.4%Triton X-100 PBS配)室温1~3h。

(17)0.05mol/l PBS冲洗4×5min。

(18)TSM1冲洗2×5min。

(19)TSM2冲洗2×5min。

(20)硝基四氮唑蓝(NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)0.2mg/ml混合液显色,室温,暗处3h。

(21)20mmol/l EDTA,pH8.0终止显色。

(22)甘油明胶直接封片。

结果:杂交阳性部位着蓝黑色。

组织处理及预杂交所用器皿需高温消毒,实验者需戴手套。

(三)酶促生物素标记cRNA探针的应用

基本方法和放射性标记cRNA探针同,所不同的是探针浓度为2.5μg/μl。显示探针反应步骤如下。

(1)用PBS冲洗粘附有切片的载片2×3min。根据情况也可用漂洗法。

(2)将载片浸入0.3%H2O2在PBS或甲醇内30min以封闭内源性过氧化物酶。

(3)PBS冲洗2×3min,用吸水纸拭干切片周围的水份,加入小鼠抗生物素血清1:100和PBS含正常羊血清(1:30),室温1h,或4℃过夜。

(4)PBS彻底冲洗。

(5)载片加生物素化抗小鼠IgG(1:100)30min室温。

(6)PBS彻底冲洗。

(7)应用ABC复合物与等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h,室温。

(8)PBS彻底冲洗。

(9)将切片覆以新鲜配制的0.025%DAB溶液,0.02%H2O2,孵育3~15min。

(10)水洗,复染,脱水,透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用银染,多层ABC或PAP法加强染色效果。

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