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七、异羟基洋地黄毒甙(Digoxigenin)标记核酸探针

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1988年德国Boehringer Manheims公司推出了一种地高辛标记DNA检测试剂盒。先将地高辛甙元通过一手臂联接至dUTP上,用随机引物法标记DNA制成探针。平均每20~25个核苷酸中标记一个地高辛甙元,然后用抗地高辛抗体的Fab片段与碱性磷酸酶的复合物和NBt – BCIP底物显色检测,灵敏度达0.1pg DNA,因此可做1μg哺乳动物DNA中单拷贝基因分析。此种探针有高度的灵敏性和特异性,安全稳定,操作简便,可避免内源性干扰,是一种很有推广价值的非放射性标记探针。

标记方法步骤:(1)取一小离心管(0.5ml)插入冰浴中,加入待标记DNa 1μg/5μl,95℃变性10min,迅速移入盐冰中3min。加入六核苷酸引物2μl,Dig-dNTP标记物2μl和消毒双蒸水10μl、大肠杆菌DNA聚合酶i Klenow片段1μl(单位)。(2)短时离心,37℃孵育至少60min(20h以内)。(3)加入2μl 0.2mol/L EDTA溶液中止反应。再加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl预冷的乙醇(-20℃),放入-70℃至少30min或-20℃过夜。(4)离心(12000g)10min,弃上清,再加入70%乙醇(冷)40μl洗一次,离心,抽干,再溶于50μl TE溶液(pH8.0)中,分装,-20℃存放备用。

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