中医书籍-->西医备考-->实用免疫细胞与核酸-->第十九章 核酸(基因)分子探针-->第三节 放射性同位素标记核酸探针-->五、聚合酶链反应(PCR)标记高活性DNA探针

五、聚合酶链反应(PCR)标记高活性DNA探针

大字体 | 正常字体 | 简体 | 正體
分享到:

免责声明:本文来自互联网,文章内容仅供参考!

在0.5ml离心管内进行,反应总体积为50μl,内含模板DNA350ng,DNA引物各50pmol/L,dGTP、dCTP和dTTP各200μmol/L,[α-32P]dATp 1.1×106Bq,反应缓冲液为67mmol/l Tris—HCl pH8.8含2.5mmol/l MgCl2、6.7mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/l β-巯基乙醇、170mg/l BSA、6.7μmol/l EDTA和40μl/ml二甲亚砜。将反应管置于95℃水浴变性5min取出,加入Taq DNA聚合酶0.5~2u,在旋涡混合器上混匀简单离心一下,加入35μl石蜡油。放入65℃水浴2min,取出,立即进入PCR循环:91℃变性30s,51。C退火1min,68℃延伸2min。重复上述过程15次。最后将反应管置65℃水浴5min。反应完成,加入酵母tRNA10μg。分别测定参入和游离放射性计数,参入率为97.4%。标记DNA探针经醋酸钠酒精沉淀回收。将沉淀溶于10mmol/l Tris—HCl 、EDTA(pH8.0)100μl。用PCR方法标记的DNA探针特异性高,敏感性好,可测出的最低靶DNA量为10fg,利用PCR还可以作DNA探针的非放射性标记。

 

注意:本文来自互联网,并由中医村中医网负责收集整理!转载请注明出处!

评论: