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二、加样程序

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由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同,而出现两种加样程序,分述如下:

(一)平衡饱和加样程序

1.基本原理所谓平衡饱和,是指抗原和抗体反应达到再不结合,也不解离的平衡状态,称为饱和状态,即平衡饱和。所以,有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

2.加样程序一般先加标准物或被测样品,再加抗血清,最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合,提高抗原的竞争抑制能力。

在小分子半抗原的放射免疫分析中,标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的,前者比后者的亲合力高。因此,上述加样程序就更有必要,所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清,后加标记物。这样测定也比较稳定。

在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中,如果是双抗体分离法,抗原和标记抗原与抗体三者加样,可不分先后,有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序,但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24~48h,再加双抗体,继续温育24h,使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析,应用双抗体分离法,其流程比较长,这样的顺序同样可不分先后。

以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例:

(1)加样(单位μl;总反应体积500μl)

(2)孵育:4℃,24h

(3)分离B与F:每管加入2%加膜活性炭溶液300μl,摇匀,立即离心,去上清,测沉淀(F)的CPM数。

(二)顺序饱和加样程序

1.基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀,免疫反应6~24h,使抗原与抗体充分结合,甚至达到平衡,然后再加入标记抗原,与抗体反应12~24h,最后分离B与F,这称为顺序饱和分析法。

应用顺序饱和加样,可以提高测定方法的灵敏度。Utiger在做人促甲状腺激素(TSH)放射免疫分析时,将标记物延至第2天加入,发现其灵敏度增加两倍。如果缩短最后的温育时间,仍可取得满意的结果。所以一般认为,在顺序饱和加样中,第1次温育时间可以长,而第2次温育时间要短,这样可以提高灵敏度。但也有相反的意见,认为顺序饱和加样,是使用过量抗体,会使灵敏度受到一定影响。如果使用抗体不过量,温育时间缩短,在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物,这样既不影响加灵敏度,反而比较稳定,甚至可提高灵敏度。

2.加样程序 以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例(直接测定)。

(1)加样(单位μl;总反应体积600μl)

(2)孵育:4℃,24h。

(3)分离B与F。

无肽血浆,用于血浆的直接测定。其制备方法为:在电磁搅拌下,抽取2%加膜活性炭溶液5ml,共两管,离心、去上清。血浆5ml,倒入上述活性炭管中,加盖,充分振荡10min,离心,上清倒入上述另一活性炭管中,振荡10min,再离心,取上清,即无肽血浆。血浆中的生物活性物质被活性炭吸附而去除。

(三)计数、绘制标准曲线与测定样品含量

以活性炭分离B与F,沉淀计数是F的cpm。T—F—NSB,得B的cpm数。

计算标准管与样品管结合(B)的cpm数及与零标准管结合(B0)的比(B/B0×100%)。

用半对数纸,以标准管的B/B0为纵座标,以各标准管含量为横座标,绘制标准曲线。

根据样品的结合率(B/B0×100%),从标准曲线中找出被测样品抗原的含量,再换算成每毫升血浆含某抗原的量,或每毫克(组织湿重)含某抗原的量。

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