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四、血浆

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1.直接测定

(1)加酶抑制剂:准确采全血若干毫升,注入预冷的加有①抗凝剂0.3mol/l EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠)溶液(每毫升全血20μl)、或1%肝素(每毫升全血10μl);②抑肽酶(每毫升全血500单位)的塑料指形管中,迅速低温离心,取血浆低温保存待测。

抑肽酶有液体的(标签写的有每毫升含多少单位)与固体的(每毫升含12TIU,1TIU=900KIU,即每毫克含10800单位)。固体的抑肽酶可用生理盐水溶解,使之每20μl含500单位。

(2)酸化处理:每毫升血浆加1mol/l HCl 0.2ml,低温保存待测。测定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

以上两种方法,任选一种即可。

2.间接测定 血标本经提取后,可去除蛋白质等干扰因素,并使微量的生物活性肽浓缩,但较费时,成本也高。常用的提取方法有:

(1)柱层析提取法:有多种层析柱可供提取不同的神经肽,其中较为方便的是用Sep-pak C18层析柱提取。主要步骤步:

①柱的预处理:该柱有两头,长头连接注射器,可注入溶液与样品,短头为排出口。预处理时注入乙腈10ml。蒸馏水20ml,使柱中的生物胶活化。

②注入样品(如血浆、脑脊液、腹水、尿等):样品中的水份流出,生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前,如先去除蛋白,可增加柱子的使用时间。]

③淋洗:用4%HAC溶液100ml注入柱中,以洗去一些杂质。

④洗脱:用7ml酸性乙腈(按容积算,每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸馏水21ml)作为洗脱剂,注入柱中,把生物活性肽洗脱下来,收集在塑料指形管中。

⑤清洗:用乙腈、蒸馏水清洗柱子,以备后用。

⑥将洗脱液吹干,低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。

Sep-Pak C18柱层析,也可用于制备标记抗原时的层析纯化。

(2)加膜藻土提取法:

①抽血:用一次性塑料注射器抽取受试者静脉血4ml,置于加有肝素(125单位/ml 全血)指形管中。

②分离血浆:在4℃下离心,取出血浆。

③血浆酸化:取2ml血浆,加入1mol/l HCl 0.5ml, 摇匀。

④吸附:加入0.5%藻土悬液2ml,在水平震荡器上震30min。离心,去上清,留沉淀。

0.5%藻土县液(Fuller’s earth)的配制:

0.5gFuller’s earth

0.1gDextran T70

100ml去离子水

⑤洗脱:在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml,在漩涡振荡器上振2min,离心,取上清置于经硅化的玻管中。

80%酸性丙酮的配制:

80ml丙酮

20ml1mol/L HCl

⑥去脂:加入石油醚1ml,摇匀,脂肪溶解在石油醚中,分层后吸去上层。

⑦干燥:下层液体,置于37℃水浴中,用氮气(或空气)吹干。

⑧低温保存待测。测定时用一定量缓冲液溶解。

(3)有机溶剂提取法:常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。将溶剂按一定比例,加入标本内,混匀、振荡、离心,取上清吹干,冷藏待测。通常在有机溶剂中加入适量的酸。

在这些方法中,以柱层析法最稳定、准确,但成本高,推广不易。加膜藻土法,提取率较高,但操作复杂、费时。有机溶剂提取法操作方便,成本也低,虽稳定性较差。

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