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三、抗体有关事项

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1.血清特异性检测  为了发现新的物质或其它方法未能显示的物质、而又无相应抗体可购买时,往往需要自己制备抗血清。制备时应检测抗血清的特异性。常用的方法有:

(1)放射免疫分析(RIA)、免疫扩散或电泳及ICC法:在制备抗血清的过程中 ,用RIA和免疫电泳等方法检测抗血清的效价是不可少的。一般认为,RIA和免疫电泳的最佳稀释度较高。ICC染色时,应从其1%的稀释度试用之较合适。在制备ICC用抗血清时,最好在应用RIA和免疫电泳法的同时结合ICC染色,以鉴定抗血清的质量(制备单克隆抗体时,仅用ICC染色筛选特异克隆即可)。因为免疫过程中,各个时期抗血清效价不同的,例如给动物免疫催产素,7周时血清ICC染色较好,RIA不佳;在10~12周期间,RIA效价升高,但ICC染色较差。因此制备ICC用抗血清时,应在ICC染色效价最佳时,收集抗血清。

(2)系列稀释第一抗体法:在一定稀释度时,抗体的特异性结合最强;继续增加抗体的稀释度,特异性反应将随之减弱至消失。因此采用系列稀释第一抗体的方法,能够验证抗血清的特异性。

2.抗体的选择  原则上应选择在较高稀释度时染色较佳而背景较低、结果稳定、重复再现良好的抗体。目前供ICC研究用的抗种类繁多,制造商如林,不同的厂家的相同抗体,其价格、包装及抗体的最佳工作浓度,差异较大。所以选购时,应多听取有经验者的建议,参考文献报告,并且自己应多查找不同厂家的抗体商品目录,恰当地选购自己所需的抗体。

3.抗体最佳稀释度的检测  抗原抗体反应要求一定比例,过量或不足,均不能达到预期的结果,所以ICC染色时,应进行抗体最佳稀释度的检测。市售抗体所附说明书均标有工作液浓度,但实际上,厂商常常给较低的稀释倍数,因此应用时,可将所给工作液浓度稀释数倍至数百倍再进行系列染色,选择其中特异性染色最强、背景着色最低的释释度作日常ICC染色浓度。在抗体来源不明、又无任何可供参考依据时,则可从原液至数倍稀释试用。另外,酶标抗体/连结抗体和PAP复合物等也需要确定最佳工作液浓度。一般认为酶标抗体可用稍离浓度,例如HRP标记抗体为1:80~160、ALP标记抗体为1:50~100染色较理想。PAP法染色时,连结抗体稀释1:50、PAP复合物用1:50~200染色较合适。

4.抗体的保存  为确保ICC染色结果稳定、再现性良好,应避免抗体反复冻融所致的效价降低。第一抗体分装、冷冻保存为佳,其最小包装可为每次用量或2周内用量。例如某抗体的工作液浓度1:1000~2000,每次染色需抗体量为1~4ml时,则所需原液为1~2μl。将原液分装成几微升难度较大,所以先将原液稀释为1:10~100,每支离心管内10~100μl保存,应用前稀释至工作液浓度。后者不宜冰冻,4℃可保存2~3周,原液和1:10~100的抗体在-80℃可保存数年而染色结果不变。单克隆抗体为培养液上清或腹水时,应4℃保存,应早应用。酶标抗体和PAP复合物原液4℃保存1年左右,免疫活性和酶活性不发生改变,大量制备的酶标抗体/PAP复合物最好分装后于-80℃或-20℃保存。所分装的抗体,应注明名称,稀释度、量及日期等,同时应在笔记本详细记录。ICC研究所用的任何抗体及酶,均应严格记录,妥善管理,才能保证实验成功。

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