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(二)本科标抗体的制备(Boosma,DM, 1983)

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从理论上讲,用细胞化学方法能显示的酶,均可用于标记抗体,进行ICC染色,但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1,供选用时参考。

表4-1 免疫细胞化学常用的酶

Sternberger(1986)指出,用于标记的酶应具备以下几点①酶催化的底物必须是特异的,且容易被显示,所形成的产物易于光镜或电镜下观察;②所形成的终产物沉淀必须稳定,即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散,影响组织学定位;③较易获得的酶分子,最好有商品出售;④中性pH时,酶应稳定,酶标记抗体后,保存1~2年活性不应改变,且酶的催化活性(Turnover)越高越好;⑤酶标过程中,酶与抗体连结,不能影响二者的活性;⑥被检测组织中,不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。

其中,①②两点甚为重要,因为并非容易显示的酶均能形成不可溶性的复合物。一般认为,辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP)较佳,是最常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界,以植物辣根(西洋山嵛菜)的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白,糖占16%~18(8条糖链分布在HRP分子表面),分子量40kD,最适pH5~5.5,最适温度40~45℃; pH4~11,50℃以下均较稳定,易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。酶的活性中心含铁卟啉,称辅基,最大吸收光谱为403nm,而其余非活性的酶蛋白部分吸收光谱为275nm,HRP的纯度是用二者的光密度比值(Od 403/275)衡量,Reinheit Zahl (RZ)表示。一般认为,标记酶的RZ值为3.0左右,不应小于2.8,RZ值越小,酶的纯度越差,例如RZ值为0.6的酶,含非活性的酶蛋白量高达75%。对于纯度低、质量差的酶,需纯化后使用。

除HRP外,碱性磷酸酶(Alkalinephasphotase, ALP)和葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)也较常用。ALP分子量约为HRP的2~3倍,最适pH9.0~9.5左右,比较稳定,内源性ALP也较易消除,大部分均可被左旋咪唑(Levamisole,分子量240.8kD)抑制,但肠粘膜表面的内源性ALP活性不受影响。目前所用的ALP大多系由牛的肠粘膜提取制得,所以肠粘膜等呈强阳性反应。

ALP最初是由Bulman等用于标记抗体的。选用不同的底物,可形成不同颜色的终产物,例如以萘酚(As-Mx)和快蓝(Fast Blue, FB)为底物,生成蓝色沉淀。用快红(Fast Red, FR)代替FB,形成红色不溶沉淀。与HRP/4-氯-1-萘酚(CN)或DAB形成的沉淀形成鲜明对比,但FB、FR等沉淀物溶于有机溶剂,不能进行脱水、透明等处理。据报告,利用新品红(New fuch-sine )显色,形成的红色沉淀产物不溶于有机溶剂,不褪色,轻度核复染后,可制成半永久性保存标本。

GOD所催化的底物为葡萄糖,电子供体为对硝基四唑蓝(P-Nitroblue Tetrazolium),终产物为不溶性的蓝色沉淀,比较稳定。从理论上讲GOD较ALP、HRP为佳,因为哺乳动物组织内不存在内源性GOD,但其分子量较大,具有较多的氨基,在标记时易形成广泛的聚合,影响酶的活性,故GOD主要用于ICC双重染色和两种酶的放大技术。

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