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二、细胞和组织的固定

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(一)固定

为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构,防止组织自溶,有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固,终止或抑制外源性和内源性酶活性,更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性,使水溶性抗原转变为非水溶性抗原,防止抗原弥散。

不同抗原,其稳定性也不相同,因而对固定剂的耐受性差异较大。如T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原,对固定剂的耐受较差,抗原活性容易丧失。而HBsAg属稳定性抗原,其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。

(二)固定剂

用于免疫组织化学的固定剂种类较多,性能各异,在固定半稳定性抗原时,尤其重视固定剂的选择,介绍如下。

1.醛类固定剂双功能交联剂,其作用是使组织之间相互交联,保存抗原于原位,其特点是对组织穿透性强,收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好,背景清晰,是常用的固定剂。

(1)10%钙-福尔马林液(浓甲醛10ml,饱和碳酸钙90ml)。

(2)10%中性缓冲福尔马林液(浓甲醋10ml,0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml)。

(3)4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4(多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml,两者混

合加热至60℃,搅拌并滴加1nNaOH至清晰为止,冷却后加PBS液至总量1000ml)。

(4)戊二醛-甲醛液(戊二醛1ml,浓甲醛10ml,蒸馏水加至100ml)。

戊二醛是二醛基化合物,交联结合力比甲醛大,Bullock认为交联过强,可出现组织改变和空间遮蔽现象,影响组织的抗原性。但McDonald等认为,该试剂用于PAP法免疫酶标记效果仍满意。

(5)甲醛升汞固定液(即B5固定液。浓甲醛10ml,氯化汞6g,醋酸钠1.25g,蒸馏水90ml)。

有人认为此固定液悬液是较理想的固定液,标记IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人认为它减弱细胞的抗原性,上皮细胞可产生非特异性荧光,故不宜用于免疫荧光标记。氯化汞是一种强蛋白凝固剂,但对组织穿透性弱,且使组织收缩,故与甲醛混合使用。

(6)醋酸-甲醛液(浓甲醛10ml,冰醋酸3ml,生理盐水加至100ml)。

Bullock等认为此液固定效果良好,组织可不经消化,胞浆IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J链标记均呈阳性,且背景染色极淡。如标记IgG用PAP法第一抗体仅为甲醛升汞液的1/10。此液内醋酸既可防止组织收缩,又可暴露胞浆免疫球蛋白抗原决定簇。

(7)Bouin’s液。

该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一,对组织穿透力较强而收缩性较小,比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好,但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性,故必需加大第一抗体的浓度。

(8)Zamboni’s液。

该固定液可用于电镜免疫细胞化学,对超微结构的保存优于纯甲醛,也适用于光镜免疫细胞化学研究。采用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸,更可增加对组织穿透力和固定效果,以保存更多的组织抗原。固定时间6-18h。

(9)PLP液(过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液)。

该固定剂适用于富含糖类的组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基,通过赖氨酸的双价氧基与醛基结合,从而与糖形成交联。组织抗原大多数是由蛋白质和糖两部分构成,抗原决定簇位于蛋白部分,故该固定液有选择性地使糖类固定,既稳定缺的,又不影响其在组织中的位置(固定剂7-9配制法见附录1)。

2.非醛类固定剂Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出,碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定,单独使用时,边缘固定效应重,但与戊二醛或多聚甲醛混合使用,效果明显改善。

(1)碳化二亚胺(1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI)液:2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS中。此液宜用于标记多肽类激素的组织,对标记IgA、IgG效果不佳。

(2)碳二亚胺-戊二醛液(ECD-G液):配制法见附录一。

ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimideHydrochloride],即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐,简称乙基-CDI。

该液常用于多肽类激素的固定,对酶等蛋白质固定效果良好,对细胞内抗原定位,超微结构保存好,是一种培养细胞电镜免疫细胞化学研究的良好固定剂。

(3)Zenker’s 液(重铬酸钾2.5g,氯化汞5g,硫酸钠1g,蒸馏水100ml,混合溶解后,临用时加水醋酸5ml)。

该固定液对免疫球蛋白染色最佳,固定时间约2-4h,染色前必须脱汞色素。

3.丙酮及醇类固定剂系最初免疫细胞化学染色的固定剂,其作用是沉淀蛋白质和糖,对组织穿透性很强,保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,解决的办法是和其它试剂混合使用,如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。

(1)Clarke氏改良剂(100%酒精95ml,冰醋酸5ml),用于冰冻切片的后固定。

(2)乙醚(或氯仿)与乙醇等量混合液。

Danos(1976)等认为其组织穿透性极强,即使涂片上富于过多的粘液,固定效果仍然良好,是理想的细胞固定液。

(3)AAF液:95%-100%酒精85ml,冰醋酸5ml,浓甲醛10ml。

(4)Carnoy氏液:100%酒精60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml,混合后4。C保存备用。

(5)Methacarn氏液:甲醇60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml,混合后4。C保存备用。

以上两种固定液适宜某些抗原,癌基因蛋白产物检测的 固定,P53抗癌基因蛋白产物,PC-NA等抗原的保存。

丙酮的组织穿透性和脱水性更强,常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定,保存抗原性较好,平时4。C低温保存备用,临用时,只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min,取出后自然干燥,贮存于低温冰箱备用。

以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液,用于免疫组化的固定剂种类很多(见附录),不同的抗原和标本需经过反复试验,选用最佳固定液。不少学者认为,迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织,免疫组化染色标记结果可截然不同,致使人们无所适从。选择最佳固定液标准是:①最好地保持细胞和组织的形态结构。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们,中性缓冲福尔马林(或多聚甲醛)是适应性较广泛的固定液,但固定时间不宜过长。必要时,可作多种固定液对比,从而选出理想的标准固定液。

固定组织时应注意:①应力求保持组织新鲜,勿使其干燥,尽快固定处理。②组织块不易过大过厚,必须小于2cm×1.5cm×0.3cm,尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。③固定液必须有足够的量,在体积上一般大于组织20倍以上,否则组织中心固定不良影响效果。④组织固定后应充分水洗,去除固定液造成的人为假象。

(三)固定方法

1.浸入法(Immersionmethod)将组织浸泡在固定液内,必要时可在低温(4。C)环境下进行,固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定,一般在2-12h之间。

2.灌注法(Irrigationmethod)此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉,先以krebs或生理盐水冲冼血液后,以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。置灌注动物于4。C冰箱内,次日取出脑组织或其它组织。外周组织一般在灌注后30min内取材,取组织置同一固定剂中浸入1-3h,然后修整组织块。有主张用冷固定剂(4。C)进行灌注。我们的体会是一般光镜下观察的标本,室温固定即可获满意效果。应该强调,保持组织新鲜是很重要的,据报告,肽类抗原活性在断绝血液供应后24h几乎完全丧失。

灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。灌注冲洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。浸入法主要用于活检和手术标本,以及其它不能进行灌注的组织固定。

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