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三、免疫染色

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可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是:①标记抗体与标本中抗原反应结合;②用PBS洗去未结合的成分;③直接观察结果(免疫荧光直接法);或显色后再用显微镜观察(免疫酶直接法)。在此基础上发展出间接法,多层法,双标记法等各种方法,将在本书各有关章 节 内详述。

在免疫染色中应特别注意增强特异性染色,减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题:

1.增强特异性染色的方法

(1)蛋白酶消化法:其作用是暴露抗原,增加细胞和组织的通透性,以便抗体与抗原最大限度的结合,增强特异性染色和避免非特异性染色。这种方法已广泛用于各种免疫细胞化学染色,常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶(pronase)等;也可用3mol/L尿素处理切片,达到酶消化的目的。各种酶的配制和使用方法详见附录。酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同,应根据酶的活性通过预试验确定,消化的时间还与组织固定的时间有关,一般是陈旧固定组织所需时间长,以37。C为宜。消化时间短的组织可在室温中进行。消化处理时间过长能损伤组织,易使切片脱落,应使用切片粘附剂,消化时间尽量缩短。

(2)合适的抗体稀释度:抗体的浓度是免疫染色的关键,如果抗体浓度过高,抗体分子过多于抗原决定簇,可导致抗体结合减少,产生阴性结果。此阴性结果并不一定缺少抗原,而是由于抗体过量。这种现象类似于凝集反应中的前带效应(Prozone effect )。因此,必须使用一系列稀释作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度,以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。抗体稀释度应根据:①抗体效价高,溶液中特异性抗体浓度越高,工作稀释度越高;②一般讲,应用的抗体稀释度越大,温育时间越长。③抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色;④稀释用缓冲液的种类、标本的固定和处理过程等也可影响稀释度。所以合适的稀释度应根据自己的情况测定。抗体的稀释主要是指第一抗体,因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键,应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应,减少或消除其中交叉抗体反应。

(3)温育时间:大部分抗体温育时间为30-60min,必要时可4。C过夜(约18h)。温育的温度常用37。C,也可在室温中进行,对抗原抗体反应强的以室温为佳。37。C可增强抗原抗体反应;适用于多数抗体染色,但应注意在湿盒中进行,防止切片干燥而导致失败。

(4)多层染色法:对弱的抗原可用间接法(双层)、PAP和ABC法(三层)、四或五层PAP法或ABC法,或PAP和ABC联合染色法等,可以很大程度的提高敏感性,获得良好结果。

(5)显色增敏剂的应用,如在过氧化物酶底物中加入氯化镍,可提高显色敏感度4倍。

2.减少或消除非特异性染色的方法 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色,最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:5-1:20)封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白,可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清(非免疫的)。有明显溶血的血清不能用,以免产生非特异性染色。免疫荧光染色时,可用0.01%伊文氏兰(PBS溶液)稀释荧光抗体,对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液,充分洗涤切片,能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。

3.显色反应的控制 免疫酶染色应注意控制:①成色质浓度和温育时间可调节 ,增加成色质的量和/或增加底物温育时间,可增加反应产物强度。着色太深可减少温育反应时间。②过氧化物酶显色时,H2O2较大浓度将使显色反应过快而致背景加深;过量H2O2可能抑制酶的活性。

4.复染 根据所用的染色方法和呈显颜色等,可选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色,则用苏木素将细胞核染成兰色,以便定位检测。也可用1%~2%甲基绿复染。

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