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一、抗体的制备和配制

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(一)抗体的制备

这是免疫细胞化学技术的首要试剂,必需制备具有很高特异性和敏感性的高效价抗体,这将在本书第二章 中详述。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多,许多实验室直接应用市售产品,现在我国自制抗体种类少,发展抗体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质,能够自制较好。

(二)抗体的配制

包括抗体贮存液和抗体使用液的配制方法。新制备或购进的是原液或冻干品,抗血清为全血清,单克隆抗体是培养上清液或腹水。

1.抗体贮存获得新抗体后,应先根据生产厂家提供的抗体效价,将其分装,可每10μl或100μl/支分装入安瓿或0.25ml带盖塑料管中,密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存备用,一般可保存1~2年。小量分装的抗体可1次用完,避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体,稀释的抗体不能长时间保存,在4。C可存入1~3天,超过7天效价显著降低。

2.抗体使用液的配制这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环,无论是一抗、二抗和各种标记抗体,用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少,稀释使用的各种抗体原液,以便获得最佳免疫染色结果。

(1)抗体最佳稀释度的测定方法:用已知阳性抗原切片,进行免疫染色,将其阳性强度与背景染色强度以“+”表示,可分为++++、+++、++、+、(-)。++++为最强阳性,+++为强阳性,++为较强阳性,+为弱阳性,(-)为阴性。

①直接测定法:用于测定第一抗体的最佳稀释度,其它条件稳定可靠。将一抗稀释为1:50、1:100、1:2001:400、1:500等5个稀释度滴加在阳性抗原切片上,同时设一替代和阴性对照,结果如表1-1:

表 1-1 选择最佳稀释抗血清方法

从表中结果可见,第一抗体稀释到1:400时阳性结果呈强阳性,背景染色减少,其最佳稀释度在1:400~500之间。再作1:420、1:440、1:460、1:480、1:500稀释后染色,找出最佳稀释度。

②棋盘(方阵)测定方法:当测定两种以上抗体的最佳配合稀释度时,必须采用此法(见表1-2)。

表1-2 两种以上抗体最佳配合稀释度选择表

括号内为背景染色结果

从表中可见第一抗体1:1000,第二抗体1:2000接近最佳稀释度,再将一 抗体作1:600、1:700、1:800、1:900和1:1000稀释,即可找出最佳稀释度。

(2)抗体稀释液的配制:常用0.01mol/l pH7.4PBS或TBS缓冲液作抗体稀释液。可用以下方法配制专用的抗体稀释液,防止抗体效价下降,减少抗体在组织上的非特异性吸附:取0.05mol/l pH7.4 TBS100ml,加温到60。C,再加入优质明胶100mg,搅拌溶解后,冷却至室温,加入1g牛血清白蛋白,加入NaN3200mg溶解后,过滤,分装,4。C保存。

抗体的最佳稀释度由于各种抗体的效价不同,组织中抗原强弱不一,应根据不同情况作适当的调整,以取得中等阳性稀释度为佳,因其既适合于抗原性强和含量多的标本,也可用于抗原性弱的标本。

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