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二、聚合酶链反应

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近年来,基因分析和基因工程技术有了革命性的突破,这主要归功于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2-3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察,也可用于进一步的分析。这样,少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察,而通过扩增至百万倍后直接观察到,而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。PCR反应的原理如图13-7。

图13-7 PCR原理示意图黑色线代表引物

由图可见,首先应按照欲检测的DNA的5’和3’端的碱基顺序各合成一段长约17-20余个碱基的寡核苷酸作为引物(primer),其次是将待检测的DNA变性后,加入四种单核苷酸(dNTP)、引物和耐热聚合酶。在较低的温度,引物将与待扩增的DNA链复性结合,然后的聚合酶的作用下,利用溶液中的核苷酸原料,不断延伸合成新互补链,这样,一条DNA双链就变成了两条双链。若继续按照变性(92-95℃)→复性(40-60℃)→引物延伸(65-72℃)的顺序循环20至40个周期,就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增2n,即100余万倍。PCR反应特异性强,灵敏度高,极微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。毛发、血痕,甚至单个细胞的DNA即可供PCR扩增之用。因此它用于病原体DNA的检查、肿瘤残留细胞的检出、罪犯或个体遗传物质的鉴定以及遗传病的基因诊断等。

目前已可对一系列的遗传病进行PCR诊断。如果疾病是由基因缺失引起的(如α地贫),则在缺失两端设计一对引物进行扩增,就不会得到扩增产物或只能得到缩短了的扩增产物。如果疾病是由点突变引起的,而突变的位置和性质已知,则在设计引物时使之包括突变部位,由于突变后的碱基不配对,结果无扩增片段;或者在引物设计时于其3’端设计一个错误的核苷酸,使之与突变了的核苷酸配对,其结果是正常引物不能扩增,而用错误的引物能扩增,从而可对突变的存在作出判断。

PCR技术目前有许多新的发展,用途日益扩大。例如,可用RNA为模板经过逆转录再行扩增的RT-PCR;改变两引物浓度,使其相差100倍,结果得到大量单链产物,称为不对称PCR,其单链产物可用于序列分析;在一个反应中加入多对引物同时检测多个部位的多重PCR等等。

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