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二、核酸扩增技术

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通过大肠埃希菌繁殖而增殖重组质粒,也是扩增核酸的手段。但在试管中有效扩增DNA的方法,是在90年代才开展起来的多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便,在我国发展很快。目前,PCR技术结合分子生物学实验技术(如逆转录反应杂交技术等)开发了许多PCR新技术(reverse transcriptase PCR;PCR-single strandconformation polymorphism,PCR-SSCP;巢式PCR(二次PCR);热启动PCR等)。RT-PCR用于RNA分析;PCR-SSCP分辨率高,可用于点突变分析;二次PCR特异性好,灵敏度高;热启动PCR可提高特异性。

PCR技术原理是在了解DNA一级结构基础上设计引物(primer或sense,人工合成),DNA多聚酶可识别并结合引物,以单链DNA为模板,dNTP为底物,合成其互补链。通过反复变性,反复合成互补链的过程,达到DNA扩增的目的。人的DNA扩增引物长度多为20个核甘酸。(图18-7)

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