一、诊断依据：

（一）流行病学及临床表现

（二） 实验室检查

（1）主要是中度以上细胞免疫缺陷包括：CD4+T 淋巴细胞耗竭：T淋巴细胞功能下降，外周血淋巴细胞显着减少，CD4<200/μl，CD4/CD8<1.0，（正常人为1.25～2.1），迟发型变态反应皮试阴性，有丝分裂原刺激反应低下。

（2）B淋巴细胞功能失调：多克隆性高球蛋白血症，循环免疫复合物形成和自身抗体形成。

（3）NK细胞活性下降

（4）各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤，如KS；

（三）HIV抗体检测

1.酶联免疫吸附法（ELISA）；2.明胶颗粒凝集试验（PA）；3.免疫荧光检测法（IFA）；4.免疫印迹检测法（Western Blot，简称WB法）；5.放射免疫沉淀法（RIP）。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV病毒。

（四）PCR技术检测HIV病毒

1．标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20～-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖（Ficoll）离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。

可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞（PMC）：

① 取4ml血液用Hanks液1：1稀释。

② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。

③ 2500r/min离心20min。

④ 吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。

⑤ 加入RPMI-1640生长液（10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P）,使细胞浓度为2×106/ml。

⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的靶细胞。

2．模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。

（1）从外周血单核细胞中提取DNA

方法A：

①取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。

②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。

③2500r/min离心10min，弃上清。

④沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3）中，使细胞浓度为6×106/ml。

⑤加入等体积的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/l MgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。

⑥　于37℃保湿后置冰箱保存。

该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。

方法B：

①取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。

②2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，上清液可作血清学研究用。

③用10ml0.9%NaCl（含50%葡萄糖）将沉淀的细胞洗一次。

④再用10ml 0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗两次。

⑤通过聚蔗糖-400离心，分离单核细胞。

⑥将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液（10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K）中使细胞裂解。

⑦用酚一氯仿抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。

⑧加入3倍体积的无水乙醇，于-20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。

该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。

（2）从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录

方法A：

① 5ml血液标本，通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。

② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。

③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。

④把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液（0.4mmol/L NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使细胞浓度为104/ml。

⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。

⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置-80℃保存，备用。

在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如（7）～（9）。

⑦ 取10μlRNA样品加2.7UDNase I。

⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。

⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNase A（15μg/份），37℃保温10min，置-20℃保存。

方法B：

①取5ml新鲜血浆置一支离心管内。

②40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。

③将沉淀物溶于变性液（4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇）中充分混匀.

④加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.

⑤13000r/min离心20min.

⑥轻轻将水相转移到一支新管中.

⑦加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右.

⑧13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀.

⑨沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥.

⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录.

⑾ 取10μl RNA样品.

⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/LNaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。

⒀ 42℃保温30～60min,然后93℃5min.

⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。

由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。

二、PCR扩增步骤

（一）引物的设计与合成

HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式-PCR方法，来提高检测的灵敏性。

检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。

已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。

表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及探针